Methoden in der Proteinanalytik

1 Was will die Proteinanalytik? Eine Einführung.- 2 Chromatographie.- 2.1 Gelfiltration.- 2.2 Ionenaustauschchromatographie (IEC).- 2.3 Hydrophobe Chromatographie und Umkehrphasen- Chromatographie.- 2.4 Metallchelat-, kovalente und thiophile Chromatographie.- 2.5 Affinitätschromatographie.- 2.6 Hochleistungs-Flüssigchromatographie.- Literatur.- 3 Aminosäure-Sequenzanalyse und Massenspektrometrie.- 3.1 N-terminale Aminosäure-Sequenzanalyse.- 3.2 C-terminale Aminosäure-Sequenzanalyse.- 3.3 Peptidmapping.- 3.4 Massenspektrometrie.- Literatur.- 4 Optische Spektroskopie.- 4.1 Physikalische Grundlagen.- 4.1.1 Welle-Teilchen-Dualismus des Lichtes.- 4.1.1.1 Licht als elektromagnetische Welle.- 4.1.1.2 Korpuskel-Charakter des Lichtes.- 4.1.2 Anregung von elektronischen Übergängen, Schwingungen und Rotationen.- 4.1.2.1 Anregungsbedingungen.- 4.1.2.2 Elektronenanregung.- 4.1.2.3 Anregung von Schwingungen.- 4.1.3 Absorptionsgesetz.- 4.2 Spektrometer.- 4.3 Absorptionsspektroskopie im ultravioletten und sichtbaren Bereich des Lichtes.- 4.3.1 Einleitung.- 4.3.2 Absorptionsspektren von Proteinen im ultravioletten und sichtbaren Bereich des Lichtes.- 4.3.3 Differenzspektroskopie.- 4.3.4 Konzentrationsbestimmung von Proteinen aus der Absorption bei 280 nm.- 4.3.5 Lineardichroismus.- 4.4 Circulardichroismus (CD).- 4.4.1 Grundlagen.- 4.4.1.1 Polarisation des Lichtes.- 4.4.1.2 Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus.- 4.4.2 Aufbau eines Circulardichrographen.- 4.4.3 CD-Spektren von Proteinen.- 4.4.3.1 Analyse der Sekundärstruktur.- 4.4.3.2 Analyse von Konformationsänderungen.- 4.5 Fluoreszenz-Spektroskopie.- 4.5.1 Grundlagen.- 4.5.1.1 Absorption und Emission.- 4.5.1.2 Quantenausbeute.- 4.5.1.3 Strahlungslose Desaktivierung.- 4.5.1.4 Fluoreszenz-Lebensdauer ?F und Lebensdauer ? des angeregten Zustandes.- 4.5.2 Bestimmung von Fluorophor-Abständen aus dem Energietransfer (FöRSTER-Transfer).- 4.5.3 Fluoreszenz-Polarisation.- 4.5.4 Zeitaufgelöste Fluoreszenz.- 4.5.5 Fluoreszenzspektren von Proteinen.- 4.5.6 Fluoreszenzsonden in der Proteinanalytik.- 4.6 Infrarot-spektroskopische Untersuchungen an Proteinen.- 4.6.1 Einleitung.- 4.6.2 Amidschwingungen und Proteinkonformation.- 4.6.3 FOURIER-Transform-Infrarot (FTIR)-Spektrometer.- 4.6.4 Messung der IR-Spektren von Proteinen.- 4.6.5 Auswertung der IR-Spektren von Proteinen.- 4.7 RAMAN-Spektroskopie.- 4.7.1 Einleitung.- 4.7.2 Meßtechnik.- 4.7.3 RAMAN-Spektren von Proteinen.- 4.7.4 Resonanz-RAMAN (RR)-Spektroskopie von Proteinen.- 4.7.5 FOURIER-Transform-RAMAN-Spektroskopie im nahen Infrarot-Bereich.- 4.7.6 Oberflächenverstärkte RAMAN-Spektroskopie (SERS und SERRS).- Literatur.- 5 NMR-Spektroskopie - Strukturaufklärung von Peptiden und Proteinen in Lösung.- 5.1 Physikalische und methodische Grundlagen.- 5.2 Das NMR-Spektrum.- 5.2.1 Die Chemische Verschiebung.- 5.2.2 Kopplungskonstante J.- 5.2.3 Integrale Signalintensität.- 5.2.4 Linienbreite.- 5.2.5 Relaxationszeiten T1 und T2.- 5.2.6 Kern (Nuclear)-OVERHAUSER-Effekt (NOE).- 5.3 Informationen aus NMR-Parametern zur Peptid- und Proteinstruktur.- 5.4 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie.- 5.5 Zuordnungsstrategien für Peptid- und Proteinstrukturen mittels mehrdimensionaler NMR-Spektroskopie und Molecular Modelling.- Literatur.- 6 ESR-Spektroskopie - eine Analysenmethode für paramagnetische Zentren in Proteinen.- 6.1 Einleitung.- 6.2 Grundlagen der ESR.- 6.2.1 Prinzip der ESR.- 6.2.2 ESR-Spektrenparameter.- 6.2.2.1 g-Faktor.- 6.2.2.2 Hyperfeinstruktur.- 6.2.2.3 Linienbreiten (Relaxationszeiten).- 6.2.2.4 Intensität.- 6.2.3 ESR-Spektrometer (Prinzipieller Aufbau).- 6.2.3.1 Probentemperierung und Küvettenform (X-Band-ESR).- 6.2.4 Spezialtechniken der ESR.- 6.2.4.1 Verbesserung der spektralen Auflösung.- 6.2.4.2 Techniken zur Analyse kurzlebiger Radikale.- 6.2.4.3 Räumliche Auflösung (Imaging).- 6.3 Paramagnetische Zentren in Proteinen.- 6.3.1 Metallkomplexe im aktiven Zentrum von Enzymen.- 6.3.2 Natürliche Radikale und Enzymfunktion.- 6.3.2.1 Proteingebundene Aminosäureradikale.- 6.3.2.2 Radikale bei Enzymreaktionen (Redoxenzyme).- 6.3.3 Radikale als Defekte in bestrahlten Proteinen.- 6.3.4 Radikalische Spinsonden – Konformationsdynamik von Proteinen.- 6.3.4.1 Prinzip der Spinmarkierung.- 6.3.4.2 Kovalente Proteinmarkierung.- 6.3.4.3 Nichtkovalente Proteinmarkierung.- 6.3.4.4 Markierte Effektormoleküle.- Literatur.- 7 Lichtstreuung und Sedimentationsanalyse.- 7.1 Einleitung.- 7.2 Lichtstreuung.- 7.2.1 Grundlagen der klassischen Lichtstreuung.- 7.3 Dynamische Lichtstreuung.- 7.3.1 Grundlagen der dynamischen Lichtstreuung.- 7.4 Sedimentationsverhalten von Proteinen.- 7.4.1 Experimentelle Bestimmung der Sedimentationskoeffizienten mit der analytischen Ultrazentrifuge.- 7.4.2 Aktive Enzymsedimentation.- 7.4.3 Nachweis einer molekularen Heterogenität.- 7.4.4 s-M-Beziehung.- 7.4.5 Flotation.- 7.5 Diffusion.- 7.5.1 Experimentelle Bestimmung der Diffusionskoeffizienten.- 7.5.1.1 Analyse integraler Konzentrationsverteilungskurven.- 7.5.1.2 Analyse differentieller Konzentrations- verteilungskurven.- 7.6 Das partielle spezifische Volumen.- 7.6.1 Wägemethoden.- 7.6.2 Schwingungsmethoden.- 7.6.3 Zentrifugationsmethoden.- 7.6.4 Rechnerische Bestimmung.- 7.7 Trennleistung der analytischen Ultrazentrifugen.- 7.8 Sedimentationsgleichgewichts-Experimente.- 7.8.1 Technik des Sedimentationsgleichgewichts- Experiments.- 7.8.2 Auswertung von Sedimentationsexperimenten.- 7.9 Berechnung weiterer Molekülparameter aus den Primärdaten.- 7.9.1 Molekülgestalt.- 7.9.2 Das Molekülvolumen.- 7.9.3 Der Virialkoeffizient.- 7.9.4 Konformationsänderungen.- 7.9.5 Assoziationsgleichgewichte.- Literatur.- 8 Thermodynamische Untersuchungen an Proteinen.- 8.1 Grundgleichungen.- 8.2 Kalorimetrie.- 8.2.1 Mischungs-und Titrationskalorimeter.- 8.2.2 Scanning-Kalorimetrie.- 8.3 Ligandenbindung.- 8.4 Proteinfaltung und Proteinstabilität.- 8.5 Weitere analytische Anwendungen thermodynamischer Methoden.- 8.5.1 Der Enzymthermistor...- 8.5.2 Die kalorimetrische Reinheitsanalyse von Lipiden.- 8.5.3 Kalorimetrie an lebenden Mikroorganismen.- Literatur.- 9 Bioinformatik: Proteinsequenzen und Sekundärstruktur-Vorhersagen.- 9.1 Verfahren von CHOU und FASMAN.- 9.2 Die GOR-Methode.- 9.3 Die SIMPA-Methode von GARNIER und LEVIN.- 9.4 Die Verfahren von LIM sowie von FINKELSTEIN und PTITSYN.- 9.5 Grenzen einer Generation von Vorhersageverfahren.- 9.6 Datenbanken und Forschungsnetze.- 9.7 Ähnlichkeit von Sequenzen und Alignments.- 9.8 Strukturvorhersage durch Sequenzhomologie.- 9.9 Die Methode von BENNER und GERLOFF.- 9.10 Das PHD-Verfahren von ROST und SANDER.- 9.11 Vorhersagen über die Sekundär struktur hinaus.- Literatur.- 10 Markierungsmethoden.- 10.1 Kovalente Markierung.- 10.1.1 Radioaktive Markierung.- 10.1.2 Nichtradioaktive Markierung.- 10.1.2.1 Das Biotin-(Strept-)Avidin-System.- 10.1.2.2 Markierungen mit Haptenen.- 10.1.2.3 Markierungen mit Fluoreszenz-und Spinmarkern.- 10.1.2.4 Affinitätsmarkierung.- 10.1.2.5 Enzym-Konjugate.- 10.1.2.6 Quervernetzung von Proteinen (cross-linking).- 10.2 Adsorptive und biospezifische, nichtkovalente Markierung.- Literatur.- 11 Elektrophoretische Techniken.- 11.1 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE).- 11.1.1 SDS-PAGE.- 11.1.2 Nichtdenaturierende PAGE und Affinitätselektrophorese.- 11.2 Agarose-Gelelektrophorese und Immunelektrophorese.- 11.3 Isoelektrische Fokussierung und zweidimensionale Elektrophorese.- 11.3.1 Isoelektrische Fokussierung.- 11.3.2 Zweidimensionale Elektrophorese.- 11.4 Nachweisverfahren in der Elektrophorese.- 11.4.1 Färbemethoden.- 11.4.2 Autoradiographic und Chemoluminiszenz.- 11.4.3 Zymogramme.- 11.5 Blottingtechniken.- 11.6 Kapillarelektrophorese.- Literatur.- 12 Immunchemie.- 12.1 Einleitung. Klassifizierung und Aufbau von Antikörpern.- 12.2 Quantitative Proteinbestimmungen.- 12.3 Antikörpergewinnung.- 12.3.1 Immunisierung.- 12.3.2 Polyklonale Antikörper.- 12.3.3 Monoklonale Antikörper.- 12.3.4. Phagen-Display-Technik.- 12.4 Antikörper-Reinigung und-Fragmentierung.- 12.5. Bispezifische Antikörper.- 12.6. Immunoblotting-Techniken.- 12.7 Immunoassays.- 12.7.1 Heterogene Immunoassays.- 12.7.2 Homogene Immunoassays.- 12.7.3 Immunosensoren.- 12.8 Epitopmapping.- 12.9 Immunaffinitätschromatographie und Immunpräzipitation.- 12.10 Katalytische Antikörper (Abzyme).- Literatur.- 13 Biochemische Methoden: Rezeptoren und Enzyme.- 13.1 Charakterisierung von Rezeptoren (Rezeptor-Bindungstests).- 13.2 Bestimmung von Enzym-Parametern.- Literatur.